（一）选择载体
DNA 载体（vector）是将外源目的基因导入宿主细胞的必要工具，外源基因必须与载体形成重组DNA 后进入宿主细胞，才能在宿主细胞内稳定地复制和表达外源基因。载体可分为基因克隆和基因表达两类。常用的克隆载体有质粒（plasmid）、病毒（噬菌体）和考斯质粒（cosmid）。用细菌做宿主细胞表达目的基因时常用质粒，用细胞做宿主时则用病毒或考斯质粒。
（二）目的基因和载体DNA 连接形成重组DNA 分子
（1）黏性末端连接法：用相同的内切酶切割克隆片段和DNA 载体片段。DNA 克隆片段和线性化载体具有相同的黏性末端，各黏性末端碱基互补，形成氢键而黏合。同时在连接酶的作用下，由ATP 供能，在DNA 克隆片段和载体片段的末端形成3′，5′‐磷酸二酯键，生成稳定的重组DNA 分子。一般主张用两种不同的内切酶切割DNA，使DNA 克隆片段两端含有不同的黏性末端，并用这两种酶切割载体DNA，然后再进行克隆，降低克隆片段和载体的自身连接。
（2）钝性末端连接法：无论欲克隆的DNA 片段与载体DNA 是否具有相同的钝性末端，都可在连接酶的作用下形成磷酸二酯键而重组。这种体系中DNA 片段的摩尔浓度和消耗的ATP 以及所需连接酶均较黏性末端连接法多，重组效率很低。
（3）钝性末端连接人工合成的接头：例如在DNA 片段分别连接人工合成的EcoR Ⅰ接头和Hind Ⅲ接头，然后用EcoRⅠ和Hind Ⅲ切割，形成酶切末端，再与含有相同末端的载体DNA 连接。
（4）同聚物末端连接法：在DNA 多核苷酸末端转移酶催化下，DNA 片段的3′‐OH 接上dC‐同聚物或d A‐同聚物，载体DNA3′‐OH 接上dG‐同聚物或dT‐同聚物。然后依靠碱基配对原理，使末端同聚物化的DNA 片段和载体进行重组。
