目的基因与载体重组

2013年01月15日 14:24

  (一)选择载体

  DNA 载体(vector)是将外源目的基因导入宿主细胞的必要工具,外源基因必须与载体形成重组DNA 后进入宿主细胞,才能在宿主细胞内稳定地复制和表达外源基因。载体可分为基因克隆和基因表达两类。常用的克隆载体有质粒(plasmid)、病毒(噬菌体)和考斯质粒(cosmid)。用细菌做宿主细胞表达目的基因时常用质粒,用细胞做宿主时则用病毒或考斯质粒。

  (二)目的基因和载体DNA 连接形成重组DNA 分子

  (1)黏性末端连接法:用相同的内切酶切割克隆片段和DNA 载体片段。DNA 克隆片段和线性化载体具有相同的黏性末端,各黏性末端碱基互补,形成氢键而黏合。同时在连接酶的作用下,由ATP 供能,在DNA 克隆片段和载体片段的末端形成3′,5′‐磷酸二酯键,生成稳定的重组DNA 分子。一般主张用两种不同的内切酶切割DNA,使DNA 克隆片段两端含有不同的黏性末端,并用这两种酶切割载体DNA,然后再进行克隆,降低克隆片段和载体的自身连接。

  (2)钝性末端连接法:无论欲克隆的DNA 片段与载体DNA 是否具有相同的钝性末端,都可在连接酶的作用下形成磷酸二酯键而重组。这种体系中DNA 片段的摩尔浓度和消耗的ATP 以及所需连接酶均较黏性末端连接法多,重组效率很低。

  (3)钝性末端连接人工合成的接头:例如在DNA 片段分别连接人工合成的EcoR Ⅰ接头和Hind Ⅲ接头,然后用EcoRⅠ和Hind Ⅲ切割,形成酶切末端,再与含有相同末端的载体DNA 连接。

  (4)同聚物末端连接法:在DNA 多核苷酸末端转移酶催化下,DNA 片段的3′‐OH 接上dC‐同聚物或d A‐同聚物,载体DNA3′‐OH 接上dG‐同聚物或dT‐同聚物。然后依靠碱基配对原理,使末端同聚物化的DNA 片段和载体进行重组。

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