(一)宿主细胞无性繁殖基因 含基因的DNA 片段
与载体DNA 重组,引入宿主细胞,外源基因受宿主细胞DNA 复制酶体系的催化进行复制,从而大量地无性繁殖外源基因。
(二)聚合酶链反应扩增基因
聚合酶链反应(poly merase chain reaction,PCR)是一种非常有效而且简便的体外基因扩增技术。
PCR 是由模板变性(denaturation)、引物退火(annea ling)及DNA 聚合酶催化下延伸(extension)新生链三个简单步骤组成的重复循环反应。模板DNA 需加热至95℃,充分解离成单链;当温度下降至55℃左右时,人工合成的一对寡核苷酸引物(20~30bp)互补结合到模板链两侧末端,在含Mg2 +和4 种dNTP 缓冲液中,耐高温的DNA 聚合酶从引物3′‐OH 端催化合成与模板链互补的新生链。由于每一循环中合成的产物可作为下一循环的模板,因此,经几次循环,模板DNA 的拷贝数即按几何级数增长(2n),20个PCR 循环使基因扩增220。