限制性核酸内切酶多数从大肠杆菌中制备，能识别DNA 分子内部特异的对称顺序［通常为4～8个碱基对（base pair，bp；千碱基对kbp，简写kb）］，对称部位的一条链旋转180°，则两条链顺序完全相同。限制性核酸内切酶水解切断每条链的一个3′，5′‐磷酸二酯键，形成5′‐PO4末端和3′‐OH 末端。有的限制性核酸内切酶在不同的平面上切割DNA 的两条单链，其切割点在旋转对称轴上，切割后两条单链末端不在同一平面上，使每条链上都留下一段（约2～6个核苷酸）伸出来的单链，这段单链的顺序很有规律，不论哪一条，从5′→3′端读去，结构相同，因为DNA 是逆行排列碱基互补的双链，所以这两段单链的碱基彼此互补，可再次形成氢键，使DNA 重新环化。这种限制性核酸内切酶切下的末端称为黏性末端。有的限制性核酸内切酶在同一平面上切割DNA 的双链，切割后，两条单链的末端在同一平面上，称钝性末端（或平头末端）。钝性末端不能自行环化。无论黏性末端或钝性末端均必须在连接酶催化下才能在两个末端之间再次形成磷酸二酯键，使DNA 片段真正稳定地连接起来。