（一）合成部位
肝脏及小肠是合成甘油三酯的主要场所，以肝脏合成能力最强，但肝脏不能储存甘油三酯，合成后即分泌入血。脂肪组织是机体合成甘油三酯的另一重要组织，它可利用食物脂肪中的脂肪酸合成甘油三酯，主要是以葡萄糖为原料合成。小肠粘膜则主要利用脂肪消化产物再合成甘油三酯，以乳糜微粒形式经淋巴进入血循环。
（二）合成原料
合成甘油三酯所需的甘油主要由葡萄糖提供，也可是细胞内甘油的再利用。生物合成脂肪酸的直接原料是乙酰辅酶A，凡是能够生成乙酰辅酶A的物质都可以成为合成原料，主要亦来自于糖的分解，部分来源于食物脂肪水解和脂肪酸动员。
（三）甘油三酯的生物合成
人体组织合成甘油三酯有两条途径：一种是利用食物中的脂肪转变为人体的脂肪，由于一般食物中摄入的脂肪量不多，故这种来源的脂肪较少；另一种是将糖类转化为脂肪，这是体内脂肪的主要来源。
葡萄糖循糖酵解途径生成3‐磷酸甘油，脂肪酸经活化转变为脂肪酰辅酶A，两分子的脂酰辅酶A经转酰基酶的催化，将酰基转移到磷酸甘油分子上，生成磷酸甘油二酯，然后经水解脱去磷酸再与另一分子脂酰辅酶A作用，生成甘油三酯。
肝脏甘油三酯的合成：肝脏合成甘油三酯是利用甘油磷酸途径，肝细胞没有甘油单酯途径的合成酶系。在脂肪酸动员期间，水解脂肪产生的甘油从脂肪组织经血流运送到肝脏，肝脏的强活性甘油激酶将甘油活化产生Sn‐甘油‐3‐磷酸，后者作为合成甘油三酯的酰化受体，酰化反应有一定的专一性，饱和脂肪酸通常酰化在甘油分子的C1和C3位置，而多烯酸无例外是在C2位。肝脏合成甘油三酯和磷脂在磷脂酸处分路，用于合成甘油三酯和磷脂的甘油二酯有差异，这可能是由于酶的专一性和细胞区域化所致。改变新合成的甘油三酯和磷脂分子的另一途径是通过转酰基反应改组脂肪酸，改组过程至少需要两类酶：磷脂酶或脂肪酶将磷脂或甘油三酯分别转变成溶血磷脂酰胆碱或甘油二酯（或甘油单酯）；还要一种转酰基酶催化转酰基反应执行脂酰基的交换。
2﹒溶血磷脂酰胆碱＋甘油三酯＝磷脂酰胆碱＋甘油二酯
3﹒溶血磷脂酰胆碱＋甘油二酯＝磷脂酰胆碱＋甘油单酯
脂肪组织的甘油三酯合成：脂肪组织也是利用甘油磷酸途径合成甘油三酯，甘油单酯途径不占主要地位。脂肪组织没有甘油激酶，脂肪酸动员期间水解脂肪产生的甘油不能被利用，只能经血流运送到肝脏。合成甘油三酯的Sn‐甘油‐3‐磷酸来自糖酵解，脂肪组织没有甘油三酯分子内的脂肪酸改组反应，少量脂肪酸模式的改变是通过水解和重新酰化反应，而不是通过转酰基反应。
小肠内甘油三酯的合成：小肠内甘油三酯合成主要是甘油单酯途径。食物脂肪在小肠内经脂肪酶水解产生脂肪酸和2‐单酰基‐Sn‐甘油（即2‐甘油单酯）被粘膜细胞吸收，脂肪酸经活化产生的酰基辅酶A作为酰基供体。小肠甘油三酯合成有85%通过甘油单酯途径，15%通过甘油磷酸途径。进入小肠的2‐甘油单酯有70%是以完整的分子形式被细胞吸收，而被吸收的2‐甘油单酯又能裂解产生脂肪酸和甘油。小肠粘膜有甘油激酶催化产生Sn‐甘油‐3‐磷酸，从甘油单酯途径和甘油磷酸途径都产生甘油二酯，二者的脂肪酸模式不同，有实验证据表明这两条途径所产生的甘油二酯在小肠细胞内有不同的代谢库。
甘油三酯大部分储存于腹腔（包括大网膜、肠系膜和肾脏周围等）、皮下和肌肉间的脂肪组织中。但合成途径不同，储存的部位也有所不同，一般情况下，脂肪组织合成的甘油三酯主要是就地储存，肝及小肠粘膜上皮合成的甘油三酯不能在原组织细胞内储存，而是以极低密度脂蛋白或乳糜微粒入血并被运送到脂肪组织内储存或运送到其他组织内利用。
细胞内大量的酶促反应受各种不同的调节控制。底物浓度影响酶反应速度，膜的通透性对调节底物浓度起重要作用，酶的全程合成和酶的变构效应也是重要的调控因子。这些调节机制之间的错综复杂的相互关系在体内巧妙地调节控制着代谢过程，甘油三酯的合成也不例外。
动物体脂肪内甘油三酯维持着动态平衡，在正常进食情况下，过量的脂肪酸合成甘油三酯在体内贮存起来，外源的脂肪酸在体内可经链延长、链缩短、加氢或去饱和反应，从而改变脂肪酸的结构，并对甘油三酯分子的脂肪酸模式进行改组。从糖类代谢产生的乙酰辅酶A全程合成的脂肪限于饱和脂肪酸和单烯酸，因为动物没有合成亚油酸的能力，必需脂肪酸（亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸）必须靠食入植物油供给。
激素对甘油三酯的合成起着重要的作用，胰岛素刺激甘油三酯合成，胰岛素的作用有二：其一是促进葡萄糖透过脂肪细胞和肌肉细胞膜，加速糖酵解和戊糖磷酸支路，从而给脂肪酸合成和甘油三酯合成提供原料；另外，胰岛素还能增强有关合成酶的活性。
脂肪组织内游离脂肪酸的流入和流出的速度也是在激素的控制之下，特别是胰岛素和肾上腺素。胰岛素促进游离脂肪酸流入，而肾上腺素能激活脂解过程，促进脂肪酸流出。血流内游离脂肪酸的含量取决于脂肪组织内甘油三酯的降解与合成之间的比例。激素通过这些作用调节控制着甘油三酯的水解和合成，因此影响脂肪酸动员的激素也同样是调节控制甘油三酯合成的因素，调节脂肪酸合成的因子也同样影响甘油三酯的合成。
甘油三酯的合成也受反馈调节，乙酰辅酶A羧化酶的变构效应物柠檬酸和酰基辅酶A相互竞争地调节着脂肪酸合成限速酶（乙酰辅酶A 羧化酶），从而也影响着甘油三酯的合成。嘌呤霉素对甘油三酯合成的抑制作用则归因于对酶蛋白合成的受阻。
