临床助理医师考试答疑：蛋白质的理化性质

　　临床助理医师考试生物化学知识点蛋白质的理化性质及相关习题解析。

　　1. 等电点

　　蛋白质分子末端有自由的α-NH3+ 和α-COO- ；蛋白质分子中氨基酸残基侧链也含有可游离的基团，如赖氨酸的ε-NH3+ 、精氨酸的胍基、组氨酸的咪唑基、谷氨酸的γ-COO- 和天冬氨酸的β-COO- 等。这些基团在溶液一定pH 条件下可以结合与释放H+ ，这就是蛋白质两性游离的基础。在酸性溶液中，蛋白质解离成阳离子；在碱性溶液中，蛋白质解离成阴离子。

　　在某一pH 值溶液中，蛋白质不解离，或解离成阳性和阴性离子的趋势相等，即成兼性离子。

　　此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点（pI）。

　　各种蛋白质的等电点不同，但大多数接近于pH5.0，所以在人及动物组织体液pH7.4环境下，大多数蛋白质解离成阴离子。少数蛋白质含碱性氨基酸较多，分子中含有较多自由氨基，故其等电点偏碱性；此类蛋白质称碱性蛋白质。例如，鱼精蛋白和细胞色素C等。也有少数蛋白质含酸性氨基酸较多，分子内含有较多的羧基，故其等电点偏酸性；此类蛋白质称为酸性蛋白质，例如，丝蛋白和胃蛋白酶等。

　　在等电点时，蛋白质兼性离子带有相等的正、负电荷，称为中性微粒，故不稳定而易于沉淀。可以利用蛋白质的这一特性以及各种蛋白质等电点的差异，从一混合蛋白质溶液中分离不同的蛋白质。例如，利用猪胰腺提取胰岛素（pI为5.30～5.35），可先调节组织匀浆pH 呈碱性，使碱性杂蛋白沉淀析出；再调节pH 至酸性，使酸性杂蛋白沉淀。然后再调节含有胰岛素的上清液pH 至5.3，得到的蛋白质沉淀即是胰岛素的粗制品了。

　　2. 沉淀

　　蛋白质从溶液中析出的现象，称为沉淀。沉淀蛋白质的方法有以下几种。

　　（1）盐析

　　在蛋白质溶液中若加大量中性盐，蛋白质胶粒的水化层即被破坏，其所带电荷也被中和，蛋白质胶粒因失去这两种稳定因素而沉淀。此种沉淀过程称为盐析。盐析法沉淀蛋白质常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。盐析时若溶液的pH 在蛋白质的等电点则效果最好。盐析沉淀的蛋白质不发生变性是其优点，故常用于天然蛋白质的分离；缺点是沉淀的蛋白质中混有大量中性盐，必须经透析除去。

　　（2）重金属盐沉淀蛋白质

　　重金属离子如Ag+ 、Hg2+ 、Cu2+ 、Pb2+ 等，可与蛋白质的负离子结合，形成不溶性蛋白质沉淀。沉淀的条件为pH 稍大于蛋白质的pI为宜。临床上利用蛋白质与重金属盐结合形成不溶性沉淀这一性质，抢救重金属盐中毒患者。给患者口服大量酪蛋白、清蛋白等，然后再用催吐剂将结合的重金属盐呕出以解毒。

　　（3）生物碱试剂与某些酸沉淀蛋白质生物碱试剂如苦味酸、鞣酸、钨酸等以及某些酸，如三氯醋酸、磺酸水杨酸、硝酸等，可与蛋白质的正离子结合成不溶性的盐沉淀。沉淀的条件是pH<pI.血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质干扰，制备无蛋白质的血滤液。如测血糖时可用钨酸沉淀蛋白质。另外，此类反应也可用于检测尿中的蛋白质。

　　（4）有机溶剂沉淀蛋白质

　　可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能与蛋白质争水，破坏蛋白质胶粒的水化膜，使蛋白质沉淀析出。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性，如用酒精可消毒灭菌。若在低温、低浓度、短时间则变性进行缓慢或不变性，可用于提取生物材料中的蛋白质，若适当调节溶液的pH 和离子强度，则可以使分离效果更好。优点是有机溶剂易蒸发除去。

　　3. 蛋白质的变性

　　在某些物理或化学因素作用下，使蛋白质的空间构象破坏（但不包括肽链的断裂等一级结构变化），导致蛋白质理化性质、生物学性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性作用。使蛋白质变性的因素很多，如高温、高压、紫外线、X射线照射、超声波、剧烈震荡及搅拌等物理因素；强酸、强碱、重金属盐、有机溶剂、浓尿素和十二烷基硫酸钠（SDS）等化学因素。这些理化因素都可使蛋白质变性，球状蛋白质变性后的明显改变是溶解度降低。本来在等电点时能溶于水的蛋白质经过变性就不再溶于原来的水溶液。蛋白质变性后，其他理化性质的改变，如结晶性消失、黏度增加、呈色性增加和易被蛋白水解酶水解等，均与蛋白质的空间破坏、结构松散、分子的不对称性增加，以及氨基酸残基侧链外露等密切相关。空间结构破坏必然导致生物学功能的丧失，如酶失去催化活性，激素不能调节代谢反应，抗体不能与抗原结合等。

　　蛋白质剧烈变性时其空间结构破坏严重，不能恢复，称为不可逆性变性。但某些温和蛋白质变性，时间也不是很久，除去变性因素仍可恢复其活性，称为可逆变性。例如，核糖核酸酶经尿素和β-巯基乙醇作用变性后，再透析去除尿素和β-巯基乙醇，又可恢复其酶活性。又如，被强碱变性的胃蛋白酶也可在一定条件下恢复其酶活性；被稀盐酸变性的Hb也可在弱碱溶液里变回天然Hb，但在100℃变性的胃蛋白酶和Hb就不能复性。

　　蛋白质被强酸或强碱变性后，仍能溶于强酸或强碱溶液中。若将此强酸或强碱溶液的pH 调至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物。这种现象称为变性蛋白质的结絮作用。结絮作用所生成的絮状物仍能再溶于强酸或强碱中。如再加热，则絮状物变为比较坚固的凝块；此凝块不宜再溶于强酸或强碱中。这种现象称为蛋白质的凝固作用。鸡蛋煮熟后本来流动的蛋清变成了固体状；豆浆中加少量氯化镁即可变成豆腐，都是蛋白质凝固的典型例子。蛋白质的变性和凝固常常是相继发生的，蛋白质变性后结构松散，长肽链状似乱麻，或互相缠绕，或互相穿插、扭成一团、结成一块，不能恢复其原来的结构，即是凝固。可以说凝固是蛋白质变性后进一步发展的一种结果。

　　了解变性理论有重要的实际意义，一方面注意低温保存生物活性蛋白，避免其变性失活；另一方面可利用变性因素消毒灭菌。

　　相关习题：

　　1.取一滴血浆，在pH8.6条件进行醋酸纤维膜电泳。若样品点在负极，电泳后可将血浆至少分成5种成分，跑在最前面的成分是

　　A. 纤维蛋白原

　　B.γ球蛋白

　　C.β球蛋白

　　D.α球蛋白

　　E. 清蛋白

　　答案：E

　　【解析】本试题考核用电泳法将血浆蛋白分类。血浆蛋白等电点一般在5.0左右，在pH8.6条件下带负电荷，电泳时向正极移动。由于血浆蛋白分子量大小及带电荷数量不同，电泳时移动速率不一样，用此法可将血浆蛋白分为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。清蛋白分子最小，带的电荷最多，所以跑得最快。

　　2.蛋白质的变性是由于

　　A. 肽键断裂，一级结构遭到破坏

　　B. 次级键断裂，天然构象破坏

　　C. 蛋白质分子发生沉淀

　　D. 蛋白质中的一些氨基酸残基受到修饰

　　E. 多肽链的净电荷等于零

　　答案：B

　　【解析】本题要点是蛋白质变性的概念。蛋白质的变性是指蛋白质受理化因素作用，特定的空间构象破坏，导致其理化性质的改变和生物学活性丧失。蛋白质变性的实质是维持其空间构象的次级键破坏导致的空间构象破坏。

　　3.在280nm 波长附近具有最大紫外光吸收峰的氨基酸是

　　A. 天冬氨酸

　　B. 丝氨酸

　　C. 苯丙氨酸